（一）AP的底物
AP为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP)作为底物 ，可制成片剂 ，使用方便。产物为黄色的对硝基酚 ，在405nm波长处有吸收峰 。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。
AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA作荧光测定 ，敏感度较高于用显色底物的比色法 。
（二）ELISA试剂盒HRP的底物
HRP催化过氧化物的氧化反应，代表性的过氧化物为H2O2 ，其反应式如下：
DH2+H2O2D+H2O
上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体 。在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物 ，以便作比色测定 。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2-azino-di-(3-ethylbenziazobinesulfonate-6)]。
OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后 ，在492nm处有zui高吸收峰，灵敏度高 ，比色方便 ，是HRP结合物zui常用的底物 。OPD本身难溶于水，OPD·2HCl为水溶性 。曾有报道OPD有致异变性 ，操作时应予注意。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用 。在试剂盒中，OPD和H2O2一般分成二组分 ，OPD可制成一定量的粉剂或片剂形式 ，片剂中含有发泡助溶剂，使用更为方便 。过氧化氢则配入底物缓冲液中，有制成易保存的浓缩液，使用时用蒸馏水稀释 。先进的ELISA试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02%H2O2的应用液,只需加入OPD后即可作为底物应用液 。
TMB经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液 ，可直接作底物使用 。另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量 ，zui适吸收波长为405nm 。
ABTS虽不如OPD和TMB敏感 ，但空白值极低 ，也为一些ELISA试剂盒所采用。
另一种HRP的底物为3-(4-羟基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenlypropionicacid,HPPA] ，经HRP作用后，产物显荧光，可用荧光光度计测量 。用于ELISA的优点为可加宽定量测定的线性范围。
HRP对氢受体的专一性很高 ，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(ureaperoxide) 。H2O2应用zui多，但尿素过氧化物为固体，作为试剂较H2O2方便 、稳定。试剂盒供应尿素过氧化物片剂，用蒸馏水溶解后 ，在底物缓冲液中密闭 、低温（2～8℃）可稳定1年。